تکنیک‌های شناسایی جهش‌ها
به گزارش روابط عمومی پایگاه اطلاع رسانی علوم آزمایشگاهی ایران، تکنیک الکتروفورز ژل دناتوره کننده با شیب غلظت کارآمدتر و حساس تر از SSCP و بیش از 95% قدرت تشخیص جهش ها را دارد. اما راه اندازی آن پیچیده و مشکل است. اساس این تکنیک بر این امر استوار است که در شرایط ثابت محیطی، نقطه ذوب یک قطعه از DNA دو رشته ای به توالی و ترکیب نوکلئوتید های آن بستگی دارد. دو قطعه DNA که در یک جفت باز با هم اختلاف دارند، ممکن است شرایط ذوب بسیار متفاوتی داشته باشند.
محصول PCR بر روی ژل پلی‌اکریلامید که شرایط دناتوراسیون آن از بالا به پایین در حال افزایش است (غلظت اوره و فرمامید از بالا به پایین ژل افزایش می یابد) قرار داده می شود. در این حالت، دو قطعه DNA که در یک جفت باز با هم اختلاف دارند در یک نقطه از ژل دناتوره نمی شوند. وقتی مولکول ها به سطح بحرانی دناتوره برسند، دو رشته& DNA شروع به جدا شدن می کنند.
آزمایش کوتاه شدن پروتئین
آزمایش کوتاه شدن پروتئین (PTT) برای یافتن جهش هایی طراحی شده است که طی آن اندازه پروتئین کد شده توسط ژن کوتاه می شود (جهش‌هایی مثل ایجاد کدون خاتمه، تغییر چارچوب و حذف قسمتی از ژن به‌خصوص در ژن‌های بزرگ).
برش شیمیایی فاز جامد
برش شیمیایی نوکلئوتیدهای متصل‌نشده (CCM) یکی از روش های انتخابی در تشخیص جهش می باشد. این روش قادر به شناسایی تمام جفت نوکلئوتید های متصل نشده و تک‌رشته ای می باشد. نوکلئوتیدهای متصل‌نشده، ناپایدار بوده و به شدت مستعد واکنش آنزیمی و شیمیایی می باشند. در این تکنیک ابتدا از دو ماده شیمیایی هیدروکسیل آمین و پرمنگنات پتاسیم، به منظور واکنش با بازهای سیتوزین و تیمین تک رشته ای استفاده می شود، سپس نمونه با پیپریدین مجاور شده و بازهای ناجور که در مرحله قبل تغییر یافته‌اند، بریده می شوند. قطعات حاصل از برش مرحلۀ قبل، بر روی ژل پلی‌اکریلامید دناتوران الکتروفورز می شود تا مکان بازهای جهش یافته مشخص شود. در طول زمان، این روش تغییراتی کرده است و در نتیجه مزایایی نیز کسب کرده است که می توان به موارد زیر اشاره نمود:
1.& & & پرمنگنات پتاسیم (KMnO4) جایگزین ماده سمی تترا اکسید اسمیوم (OsO4) شده است.
2.& & & اگر هر دو نمونه DNA وحشی و جهش‌یافته نشان دار شوند، شانس شناسایی جهش دو برابر خواهد شد.
3.& & & این روش حساس بوده و با مقدار نمونه کمتر از ۰/۱ میکروگرم نیز می توان جهش را شناسایی کرد.
4.& & & همه مراحل آزمایش بر روی سطح جامد ذرات سیلیکونی انجام می گیرد. در نتیجه برای تغییرات و دستکاری های بعدی مناسب است.
این تکنیک بر اساس تشکیل هترودوپلکس بنا نهاده شده است، بنابراین به منظور انجام آزمایش، دو قطعه مکمل نمونه و کنترل را با هم مخلوط کرده، ذوب می کنند. دوباره با کاهش دما، این دو رشته به هم متصل می شوند. اگر توالی این دو قطعه با هم یکسان نباشد، بر روی هترودوپلکس حاصل، باز متصل نشده و تک‌رشته ای قرار می گیرد. بازهای ناجور C,T مستعد تغییرات و برش شیمیایی می باشند. از آنجا که همۀ انواع جفت‌های ناجور C,T(CC, CT, CA, TT, TG, TC) در این روش شناسایی و بریده می شوند، پس با استفاده از DNA کاوشگر کنترل (وحشی) و جهش یافته، می توان همۀ جهش های نقطه ای را غربال گری نمود. به منظور دو برابر شدن احتمال شناسایی جهش، بهتر است که هر دو نمونه وحشی و جهش یافته را نشاندارکرد. کاوشگر DNA را می توان به صورت اولیگونوکلئوتید مصنوعی ساخت و یا با استفاده از PCR از ژنوم موجود زنده به دست آورد.
محصول PCR بر روی ژل پلی‌اکریلامید که شرایط دناتوراسیون آن از بالا به پایین در حال افزایش است (غلظت اوره و فرمامید از بالا به پایین ژل افزایش می یابد) قرار داده می شود. در این حالت، دو قطعه DNA که در یک جفت باز با هم اختلاف دارند در یک نقطه از ژل دناتوره نمی شوند. وقتی مولکول ها به سطح بحرانی دناتوره برسند، دو رشته& DNA شروع به جدا شدن می کنند.
این نقطه به عنوان نقطه ذوب عمل می کند. هرگاه قطعه DNA دناتوره شود، سرعت حرکت آن در ژل به شدت کاهش می یابد، زیرا دو تک رشته حاصل به کمک مولکول سورالن به یکدیگر متصل شده و حجم آن‌ها افزایش می یابد، در نتیجه عبور این تک رشته ها از خلال ماتریکس ژل کند می شود. مولکول سورالن پس از اتمام PCR به انتهای مولکول DNA متصل می شود. اگر هر دو آلل ژن مشابه هم باشند، محصول& PCR یک نوع DNA دو رشته‌ای خواهد داشت، در نتیجه طی آزمایش DGGE یک باند بر روی ژل مشاهده می شود. اگر دو آلل حاوی جهش بوده و جهش در هر دو آلل یکسان باشد، محصول PCR شامل یک نوع DNA دو رشته ای موتانت می باشد. در این حالت نیز در ژل الکتروفورز یک باند دیده می شود، اما محل این باند با باند DNA سالم می تواند متفاوت باشد. اگر دو آلل یک ژن از لحاظ جهش نقطه ای با هم تفاوت داشته باشند، محصول PCR به صورت هترودوپلکس خواهد بود. این هترودوپلکس‌ها پس از اتمام PCR و با حرارت دادن محصول واکنش به وجود می آیند. شیب غلظت عامل دناتوره کننده باید با توجه به توالی قطعه مورد بررسی تعیین شود و در اصطلاح با توالی قطعه سازگار باشد. قطعات استانداردی وجود دارد که با استفاده از آن ها می توان شرایط محیطی را کنترل و تنظیم نمود. در تکنیک DGGE نیازی به مواد شیمیایی سمی و یا رادیواکتیو نیست، ولی ابزارهای پیشرفته لازم است. نوع مشابهی از این روش به نام TGGE وجود دارد که در آن از حرارت به جای غلظت مواد شیمیایی در ژل استفاده می شود. برای واسرشت شدن کامل قطعات حاصل از PCR، از یک ناحیه مصنوعی حاوی بالاترین دمای ذوب به نام clamp& استفاده می شود.
آزمایش کوتاه شدن پروتئین (PTT) برای یافتن جهش هایی طراحی شده است که طی آن اندازه پروتئین کد شده توسط ژن کوتاه می شود (جهش‌هایی مثل ایجاد کدون خاتمه، تغییر چارچوب و حذف قسمتی از ژن به‌خصوص در ژن‌های بزرگ).
این روش شامل یک RT-PCR با استفاده از دو پرایمر می باشد. پرایمر منفی موجب ساخته شدن رشته شده و پرایمر مثبت در انتهای ′5 خود پروموتر فاژ T7 را به همراه دارد. قطعه RNA به روش RT-PCR تکثیر شده و به صـــــورت in vitro ترجمه می شود. قطعات ساخته شده، به یک سیستم رونویسی/ ترجمه in vitro منتقل می شوند. این سیستم که معمولاً رتیکولوسیت است، حاوی tRNA و اسیدآمینه می باشد. بعضی از اسیدآمینه های این سیستم توسط رادیواکتیو نشان دار شده‌اند. بعد از ساخت پپتید، محلول موجود در لوله بر روی ژل پلی اکریلامید حاوی SDS قرار داده می شود. الکتروفورز انجام شده و پپتید بر روی غشای نیتروسلولزی منتقل می‌شود. در این مرحله وسترن بلات و اتورادیوگرافی انجام شده و اندازه پپتید حاصل با پپتید استاندارد و سالم مقایسه می شود. این تکنیک به طور گسترده برای بررسی جهش در ژن های& (Adenomatous Polyposis Coli )APC، MSH2،& MLH1 و دیستروفین به کار می رود.
برش شیمیایی نوکلئوتیدهای متصل‌نشده (CCM) یکی از روش های انتخابی در تشخیص جهش می باشد. این روش قادر به شناسایی تمام جفت نوکلئوتید های متصل نشده و تک‌رشته ای می باشد. نوکلئوتیدهای متصل‌نشده، ناپایدار بوده و به شدت مستعد واکنش آنزیمی و شیمیایی می باشند. در این تکنیک ابتدا از دو ماده شیمیایی هیدروکسیل آمین و پرمنگنات پتاسیم، به منظور واکنش با بازهای سیتوزین و تیمین تک رشته ای استفاده می شود، سپس نمونه با پیپریدین مجاور شده و بازهای ناجور که در مرحله قبل تغییر یافته‌اند، بریده می شوند. قطعات حاصل از برش مرحلۀ قبل، بر روی ژل پلی‌اکریلامید دناتوران الکتروفورز می شود تا مکان بازهای جهش یافته مشخص شود. در طول زمان، این روش تغییراتی کرده است و در نتیجه مزایایی نیز کسب کرده است که می توان به موارد زیر اشاره نمود:
1.& & & پرمنگنات پتاسیم (KMnO4) جایگزین ماده سمی تترا اکسید اسمیوم (OsO4) شده است.
2.& & & اگر هر دو نمونه DNA وحشی و جهش‌یافته نشان دار شوند، شانس شناسایی جهش دو برابر خواهد شد.
3.& & & این روش حساس بوده و با مقدار نمونه کمتر از ۰/۱ میکروگرم نیز می توان جهش را شناسایی کرد.
4.& & & همه مراحل آزمایش بر روی سطح جامد ذرات سیلیکونی انجام می گیرد. در نتیجه برای تغییرات و دستکاری های بعدی مناسب است.
این تکنیک بر اساس تشکیل هترودوپلکس بنا نهاده شده است، بنابراین به منظور انجام آزمایش، دو قطعه مکمل نمونه و کنترل را با هم مخلوط کرده، ذوب می کنند. دوباره با کاهش دما، این دو رشته به هم متصل می شوند. اگر توالی این دو قطعه با هم یکسان نباشد، بر روی هترودوپلکس حاصل، باز متصل نشده و تک‌رشته ای قرار می گیرد. بازهای ناجور C,T مستعد تغییرات و برش شیمیایی می باشند. از آنجا که همۀ انواع جفت‌های ناجور C,T(CC, CT, CA, TT, TG, TC) در این روش شناسایی و بریده می شوند، پس با استفاده از DNA کاوشگر کنترل (وحشی) و جهش یافته، می توان همۀ جهش های نقطه ای را غربال گری نمود. به منظور دو برابر شدن احتمال شناسایی جهش، بهتر است که هر دو نمونه وحشی و جهش یافته را نشاندارکرد. کاوشگر DNA را می توان به صورت اولیگونوکلئوتید مصنوعی ساخت و یا با استفاده از PCR از ژنوم موجود زنده به دست آورد.
