تکنیک کروماتوگرافی
به گزارش روابط عمومی پایگاه اطلاع رسانی علوم آزمایشگاهی ایران، کروماتوگرافی اولین بار در سال ۱۹۰۰ توسط دانشمند ایتالیایی میخائیل تسو در روسیه به کار گرفته شد. وی در دهه اول قرن بیستم کروماتوگرافی را در وهله اول برای جداسازی رنگدانه های گیاهی مثل کلروفیل، کاروتن و زانتوفیل ها به کار گرفت. از آنجا که این ترکیبات دارای رنگ های مختلف (سبز، نارنجی و زرد) هستند، اسم این روش به کروماتوگرافی معروف شد. در حال حاضر این روش به سرعت در حال پیشرفت است و محققان به طور مداوم در حال بهبود عملکرد فنی آن هستند و هم اکنون امکان جداسازی مولکول های مشابه بیشتری را فراهم می کنند.
کروماتوگرافی عبارت جامعی است برای یک مجموعه از تکنیک های آزمایشگاهیِ مورد استفاده در جداسازی ترکیب ها؛ به بیان بهتر کروماتوگرافی یک روش جداسازی توانمند است که در تمام شاخه های علوم کاربرد هایی دارد و به طور گسترده برای جداسازی، شناسایی و تعیین اجزای سازنده شیمیایی در مخلوط های پیچیده به کار می رود.
روش های کروماتوگرافی را می توان به دو طریق دسته بندی کرد؛ اولین طریق بر اساس ابزار فیزیکی بنا شده است که به کمک آن فازهای متحرک و ساکن با یکدیگر تماس برقرار می کنند. در کروماتوگرافی ستونی، فاز ساکن در یک ستون باریک قرار دارد که از داخل آن فاز متحرک تحت تأثیر نیروی فشار عبور داده می شود. در کروماتوگرافی مسطح، فاز ساکن بر روی یک صفحه مسطح و یا در لابه‌لای یک صفحه کاغذ قرار داده می شود؛ در اینجا فاز متحرک از لابه‌لای فاز ساکن تحت اثر مویینه ای حرکت می کند.
یک دسته بندی اساسی‌تر روش های کروماتوگرافی بر پایه انواع فاز های متحرک و ساکن و انواع تعادل های درگیر در انتقال مواد حل شده بین فازها بنا شده است. سه گروه عمومی کروماتوگرافی مایع LC، کروماتوگرافی گازی GC و کروماتوگرافی سیال ابر بحرانی همان طور که از نام آن ها پیداست، فاز متحرک در سه گروه به ترتیب عبارتند از: مایعات، گازها و سیالات ابر بحرانی. به بیان دیگر، اگر فاز متحرک گاز باشد، سیستم حاصل کروماتوگرافی گازی نامیده می شود و اگر فاز متحرک مایع باشد، نتیجه یک سیستم کروماتوگرافی مایع خواهد بود. اگر فاز متحرک سیال فوق بحرانی باشد، کروماتوگرافی سیال فوق بحرانی نامیده می شود که این سیال از نظر حلالیت شبیه مایعات است و از نظر نفوذپذیری شبیه گاز هاست. کروماتوگرافی سیال فوق بحرانی یک نوع هیبرید از کروماتوگرافی گازی و مایع است که بعضی از بهترین جنبه های هردو را ترکیب می کند.
کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا
High Performance Liquid Chromatography technique
کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا روشی است توسعه یافته با مبنای کروماتوگرافی مایع که قطر ذرات داخل ستون‌های آن بسیار کوچک شده و جداسازی را بهتر انجام می دهند و همچنین در درون این سیستم ها، پمپ هایی وجود دارند که سرعت تعادلی مناسب ایجاد می نمایند. به طور کلی، استفاده از انواع آشکارسازهای اسپکتروفتومتری، فلوئوریمتری، الکتروشیمیایی، ضریب شکست و غیره و همچنین پیشرفت‌هایی که در ساخت ستون، پمپ و سایر تجهیزات HPLC پدید آمد، کارایی، سرعت جداسازی و دامنه کاربرد های این روش را به طور قابل ملاحظه ای افزایش داد.
در حال حاضر در میان روش‌ه ای مختلف جداسازی تجزیه‌ای، کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا از بیشترین رشد برخوردار می باشد. چنین رشد گسترده ای را می توان به توانایی این روش در جداسازی طیف وسیعی از مواد با نقطه جوش بالا و موادی که در اثر حرارت تجزیه می شوند، اندازه گیری های کمّی و صحیح، حساسیت، توانایی در جداسازی سریع مخلوط های پیچیده و کاربرد گسترده آن در زمینه موادی که از نظر صنعتی اهمیت دارند، نسبت داد. از میان موادی که به وسیله این روش مورد تجزیه قرار گرفته اند می توان به اسیدهای آمینه، پروتئین‌ها، اسیدهای نوکلئیک، هیدروکربن ها، کربوهیدرات ها، داروها، استروئیدها، آنتی بیوتیک ها و … اشاره نمود.
اصطلاحات کروماتوگرافی:
•آنالیت: ترکیبی است که مد نظر و مورد شناسایی ما بوده و باید از مخلوط جداسازی شود.
•فاز متحرک: فازی است که نمونه را در طول جداسازی با خود حمل می کند و می تواند بسته به نوع روش به شکل گاز یا مایع باشد.
•فاز ساکن: فازی است که با پیوندی از نوع کووالانسی به ذرات پشتیبان یا به درون دیواره ستون کروماتوگرافی متصل شده‌اند و می تواند بسته به نوع روش به شکل جامد یا مایع باشد.
•کروماتوگرام: یک خروجی بصری به شکل یک نمودار است که از ترسیم پاسخ آشکارساز به صورت تابعی از زمان یا حجم فاز متحرک حاصل می شود.
•آشکارساز: اشاره به ابزاری دارد که برای آشکار‌سازی کمی و کیفی آنالیت ها بعد از جداسازی مورد استفاده قرار می گیرند.
•زمان بازداری: مدت زمانی است که طول می کشد تا آنالیت به آشکارساز برسد و شناسایی شود. این زمان در کروماتوگرام با tR نشان داده می‌شود.
•زمان مرده: زمان بازداری یک گونه فرضی است که اصلا در فاز ساکن نگه داشته نمی‌شود. به عبارتی tM زمان بازداری فاز متحرک است.
نتیجه گیری
کروماتوگرافی یکی از متداول ترین روش های جداسازی و شناسایی مواد است. امروزه کروماتوگرافی کاربرد وسیعی در بسیاری زمینه ها شامل شیمی، داروسازی، پتروشیمی، مواد غذایی و... پیدا کرده است. روش های کروماتوگرافی در جداسازی مخلوط ترکیبات، شناسایی ترکیبات ناشناخته، تخمین خلوص و غلظت مواد، نظارت در تولید دارو در صنایع داروسازی و... کاربرد بسیاری دارند. در کروماتوگرافی، جداسازی بر اساس تمایل اجزا یک نمونه بین دو فاز و اختلاف در سرعت مهاجرت گونه‌ها است، به صورتی که اختلاف کمی در ضریب تقسیم آنها بین فاز ساکن و متحرک منجر به تفاوت در زمان بازداری در فاز ساکن شده و باعث تاثیر در جداسازی می شود.
کروماتوگرافی عبارت جامعی است برای یک مجموعه از تکنیک های آزمایشگاهیِ مورد استفاده در جداسازی ترکیب ها؛ به بیان بهتر کروماتوگرافی یک روش جداسازی توانمند است که در تمام شاخه های علوم کاربرد هایی دارد و به طور گسترده برای جداسازی، شناسایی و تعیین اجزای سازنده شیمیایی در مخلوط های پیچیده به کار می رود.
روش های کروماتوگرافی را می توان به دو طریق دسته بندی کرد؛ اولین طریق بر اساس ابزار فیزیکی بنا شده است که به کمک آن فازهای متحرک و ساکن با یکدیگر تماس برقرار می کنند. در کروماتوگرافی ستونی، فاز ساکن در یک ستون باریک قرار دارد که از داخل آن فاز متحرک تحت تأثیر نیروی فشار عبور داده می شود. در کروماتوگرافی مسطح، فاز ساکن بر روی یک صفحه مسطح و یا در لابه‌لای یک صفحه کاغذ قرار داده می شود؛ در اینجا فاز متحرک از لابه‌لای فاز ساکن تحت اثر مویینه ای حرکت می کند.
یک دسته بندی اساسی‌تر روش های کروماتوگرافی بر پایه انواع فاز های متحرک و ساکن و انواع تعادل های درگیر در انتقال مواد حل شده بین فازها بنا شده است. سه گروه عمومی کروماتوگرافی مایع LC، کروماتوگرافی گازی GC و کروماتوگرافی سیال ابر بحرانی همان طور که از نام آن ها پیداست، فاز متحرک در سه گروه به ترتیب عبارتند از: مایعات، گازها و سیالات ابر بحرانی. به بیان دیگر، اگر فاز متحرک گاز باشد، سیستم حاصل کروماتوگرافی گازی نامیده می شود و اگر فاز متحرک مایع باشد، نتیجه یک سیستم کروماتوگرافی مایع خواهد بود. اگر فاز متحرک سیال فوق بحرانی باشد، کروماتوگرافی سیال فوق بحرانی نامیده می شود که این سیال از نظر حلالیت شبیه مایعات است و از نظر نفوذپذیری شبیه گاز هاست. کروماتوگرافی سیال فوق بحرانی یک نوع هیبرید از کروماتوگرافی گازی و مایع است که بعضی از بهترین جنبه های هردو را ترکیب می کند.
اگر به طور خلاصه بخواهیم اشاره کنیم، در واقع کروماتوگرافی متکی بر حرکت نسبی دو فاز است. یکی از فازها بدون حرکت است و فاز ساکن نامیده می شود و دیگری را فاز متحرک می نامند. مخلوط نمونه بین دو فاز در بستر کروماتوگرافی (ستون یا صفحه) توزیع می شود.
High Performance Liquid Chromatography technique
کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا روشی است توسعه یافته با مبنای کروماتوگرافی مایع که قطر ذرات داخل ستون‌های آن بسیار کوچک شده و جداسازی را بهتر انجام می دهند و همچنین در درون این سیستم ها، پمپ هایی وجود دارند که سرعت تعادلی مناسب ایجاد می نمایند. به طور کلی، استفاده از انواع آشکارسازهای اسپکتروفتومتری، فلوئوریمتری، الکتروشیمیایی، ضریب شکست و غیره و همچنین پیشرفت‌هایی که در ساخت ستون، پمپ و سایر تجهیزات HPLC پدید آمد، کارایی، سرعت جداسازی و دامنه کاربرد های این روش را به طور قابل ملاحظه ای افزایش داد.
در حال حاضر در میان روش‌ه ای مختلف جداسازی تجزیه‌ای، کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا از بیشترین رشد برخوردار می باشد. چنین رشد گسترده ای را می توان به توانایی این روش در جداسازی طیف وسیعی از مواد با نقطه جوش بالا و موادی که در اثر حرارت تجزیه می شوند، اندازه گیری های کمّی و صحیح، حساسیت، توانایی در جداسازی سریع مخلوط های پیچیده و کاربرد گسترده آن در زمینه موادی که از نظر صنعتی اهمیت دارند، نسبت داد. از میان موادی که به وسیله این روش مورد تجزیه قرار گرفته اند می توان به اسیدهای آمینه، پروتئین‌ها، اسیدهای نوکلئیک، هیدروکربن ها، کربوهیدرات ها، داروها، استروئیدها، آنتی بیوتیک ها و … اشاره نمود.
اصطلاحات کروماتوگرافی:
•آنالیت: ترکیبی است که مد نظر و مورد شناسایی ما بوده و باید از مخلوط جداسازی شود.
•فاز متحرک: فازی است که نمونه را در طول جداسازی با خود حمل می کند و می تواند بسته به نوع روش به شکل گاز یا مایع باشد.
•فاز ساکن: فازی است که با پیوندی از نوع کووالانسی به ذرات پشتیبان یا به درون دیواره ستون کروماتوگرافی متصل شده‌اند و می تواند بسته به نوع روش به شکل جامد یا مایع باشد.
•کروماتوگرام: یک خروجی بصری به شکل یک نمودار است که از ترسیم پاسخ آشکارساز به صورت تابعی از زمان یا حجم فاز متحرک حاصل می شود.
•آشکارساز: اشاره به ابزاری دارد که برای آشکار‌سازی کمی و کیفی آنالیت ها بعد از جداسازی مورد استفاده قرار می گیرند.
•زمان بازداری: مدت زمانی است که طول می کشد تا آنالیت به آشکارساز برسد و شناسایی شود. این زمان در کروماتوگرام با tR نشان داده می‌شود.
•زمان مرده: زمان بازداری یک گونه فرضی است که اصلا در فاز ساکن نگه داشته نمی‌شود. به عبارتی tM زمان بازداری فاز متحرک است.
•ثابت توزیع: نسبت غلظت گونه در فاز ساکن به غلظت گونه در فاز متحرک است. هرچه مقدار k بیشتر باشد یعنی زمان ماندگاری در فاز ساکن بیشتر بوده و دیرتر شناسایی می شود.
کروماتوگرافی یکی از متداول ترین روش های جداسازی و شناسایی مواد است. امروزه کروماتوگرافی کاربرد وسیعی در بسیاری زمینه ها شامل شیمی، داروسازی، پتروشیمی، مواد غذایی و... پیدا کرده است. روش های کروماتوگرافی در جداسازی مخلوط ترکیبات، شناسایی ترکیبات ناشناخته، تخمین خلوص و غلظت مواد، نظارت در تولید دارو در صنایع داروسازی و... کاربرد بسیاری دارند. در کروماتوگرافی، جداسازی بر اساس تمایل اجزا یک نمونه بین دو فاز و اختلاف در سرعت مهاجرت گونه‌ها است، به صورتی که اختلاف کمی در ضریب تقسیم آنها بین فاز ساکن و متحرک منجر به تفاوت در زمان بازداری در فاز ساکن شده و باعث تاثیر در جداسازی می شود.
